Base estrutural para regulação de lipídios e cobre do transportador ABC MsbA

Nature Communications volume 13, Número do artigo: 7291 (2022) Citar este artigo

2580 Acessos

2 Citações

8 Altmétrica

Detalhes das métricas

Uma etapa crítica na biogênese do lipopolissacarídeo (LPS) envolve a inversão do lipooligossacarídeo, um precursor do LPS, do folheto citoplasmático para o periplasmático da membrana interna, uma operação realizada pelo transportador de cassete de ligação ao ATP MsbA. Embora a ligação do LPS à cavidade interna do MsbA esteja bem estabelecida, a seletividade das interações MsbA-lipídio em outro(s) local(is) permanece(m) pouco compreendida(s). Aqui usamos espectrometria de massa nativa (MS) para caracterizar interações MsbA-lipídeos e orientar estudos estruturais. Mostramos que o transportador co-purifica com cobre(II) e a ligação de metal modula as interações proteína-lipídio. Uma estrutura de resolução de 2,15 Å de uma região N-terminal de MsbA em complexo com cobre(II) é apresentada, revelando uma estrutura reminiscente do peptídeo GHK, um quelante de cobre(II) de alta afinidade. Nossos resultados demonstram afinidades de ligação lipídica dependentes de conformação, particularmente para o precursor de LPS, ácido 3-desoxi-D-mano-oct-2-ulossônico (Kdo)2-lipídeo A (KDL). Relatamos uma estrutura de resolução de 3,6 Å de MsbA presa em uma conformação aberta voltada para fora com adenosina 5'-difosfato e vanadato, revelando um sítio de ligação KDL distinto, em que o lipídeo forma extensas interações com o transportador. Estudos adicionais fornecem evidências de que o sítio de ligação KDL externo é conservado e um modulador alostérico positivo da atividade ATPase, servindo como um mecanismo de ativação feedforward para acoplar a atividade do transportador com a biossíntese de LPS.

Uma característica definidora da maioria das bactérias Gram-negativas é a presença de lipopolissacarídeo (LPS) no folheto externo da membrana externa1,2,3. O LPS contribui para a formação de uma barreira impermeável que ajuda as bactérias a resistirem a antibióticos e estresses ambientais2. A biogênese do LPS começa no citoplasma com a produção do lipooligossacarídeo (LOS) precursor do LPS, seguido por um transporte orquestrado para a superfície celular, juntamente com outras modificações (Fig. 1a)4. O LOS contém uma fração lipídica A conservada, um dissacarídeo bisfosforilado de glucosamina (GlcN) com quatro a sete cadeias de acil, que é decorado com açúcar do ácido 3-desoxi-D-mano-oct-2-ulossônico (Kdo)1. A decoração adicional inclui a ligação de um oligossacarídeo central, que varia em diferentes bactérias2. O LOS citoplasmático é invertido do folheto interno para o periplasmático da membrana interna, uma etapa essencial realizada pelo transportador MsbA do ATP-Binding Cassette (ABC). Como a inibição ou deleção de MsbA é letal5, o transportador emergiu como um alvo atraente para o desenvolvimento de antibióticos. Recentemente, foram desenvolvidos inibidores de MsbA de moléculas pequenas que variam no modo de ação, como prender o transportador em uma conformação voltada para dentro (IF) ou imitar a ligação do substrato6,7,8,9,10.

a A biossíntese de lipopolissacarídeos começa no citoplasma para gerar lipooligossacarídeos (LOS). LOS é composto por uma estrutura lipídica A conservada (cinza), um dissacarídeo bisfosforilado de glucosamina, modificado com açúcar do ácido 3-desoxi-D-manno-oct-2-ulossônico (Kdo) (laranja) e oligossacarídeo central (roxo), dos quais depende da bactéria. O MsbA, alimentado pela hidrólise do ATP, vira o LOS citoplasmático do folheto interno para o externo da membrana interna, uma etapa essencial na biogênese do LPS. O LOS invertido é transportado para a membrana externa junto com modificações adicionais para se tornar LPS. b O espectro de massa nativo de amostras MsbA otimizadas em C10E5 produz um espectro de massa bem resolvido. c Constantes de dissociação de equilíbrio (KD) para eventos individuais de ligação de lípidos a MsbA parcialmente carregado. d Deconvolução do espectro de massa mostrado no painel b. As diferentes espécies moleculares correspondem a MsbA dimérico e diferentes números de íons de cobre ligados. e A massa medida de MsbA após o carregamento com cobre(II) mostra a saturação de dois locais de ligação. f KDs para eventos individuais de ligação de lipídios a MsbA totalmente carregado com cobre(II). São relatados a média e o desvio padrão (n = 3, réplicas biológicas). Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de dados de origem.