Base estrutural da ativação da tankirase por polimerização

Nature volume 612, páginas 162–169 (2022) Citar este artigo

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A poli-ADP-ribosiltransferase tankyrase (TNKS, TNKS2) controla uma ampla gama de processos celulares relevantes para doenças, incluindo sinalização WNT-β-catenina, manutenção do comprimento dos telômeros, sinalização Hippo, reparo de danos no DNA e homeostase da glicose1,2. Isso incentivou o desenvolvimento de inibidores da tankirase. No entanto, nosso conhecimento dos mecanismos que controlam a atividade tankyrase permaneceu limitado. Ambas as funções catalíticas e não catalíticas da tankyrase dependem de sua polimerização filamentosa3,4,5. Aqui relatamos a reconstrução por microscopia crioeletrônica de um filamento formado por uma unidade mínima ativa de tankirase, compreendendo o domínio polimerizante do motivo alfa estéril (SAM) e seu domínio catalítico adjacente. O domínio SAM forma uma nova hélice dupla antiparalela, posicionando os domínios catalíticos salientes para interações cabeça-a-cabeça e cauda-a-cauda recorrentes. As interações da cabeça são altamente conservadas entre tankirases e induzem uma mudança alostérica no sítio ativo dentro do domínio catalítico para promover a catálise. Embora as interações da cauda tenham um efeito limitado na catálise, elas são essenciais para a função tankyrase na sinalização WNT-β-catenina. Este trabalho revela um novo modo de polimerização do domínio SAM, ilustra como a montagem supramolecular controla as funções catalíticas e não catalíticas, fornece informações estruturais importantes sobre a regulação de uma poli-ADP-ribosiltransferase não dependente de DNA e orientará os esforços futuros para modular a tankyrase e decifrar sua contribuição para os mecanismos da doença.

A poli(ADP-ribosil)ação (PARilação) é uma modificação pós-traducional onipresente, mas pouco estudada, implicada em uma ampla gama de atividades biológicas6. As poli-ADP-ribosiltransferases PARP1 e PARP2 induzidas por danos no DNA são alvos terapêuticos em cânceres de ovário, mama, próstata e pâncreas7. Embora sua regulação seja razoavelmente bem compreendida, a dos outros dois membros da família produtora de PAR, tankyrase 1 e tankyrase 2 (TNKS e TNKS2, respectivamente; Fig. 1a), não é8,9. Os processos regulados pela tankirase incluem sinalização WNT–β-catenina10, manutenção e coesão do comprimento dos telômeros11, sinalização Hippo12, metabolismo da glicose13, mitose14 e reparo do DNA15. Essas funções incentivaram o desenvolvimento de inibidores da tankirase com potencial utilidade terapêutica em câncer, neurodegeneração, diabetes e fibrose16. As tankyrases se agrupam em filamentos helicoidais através de seu domínio SAM de polimerização3,4,5,17. A polimerização da tankirase facilita (1) a ligação de substratos e (2) a ativação catalítica da PARP4,5,18 e é essencial para a função da tankirase na sinalização WNT–β-catenina, tanto por mecanismos dependentes de catálise quanto independentes de catálise (andaimes)4, 5,18.

a, Organização de domínio de TNKS e TNKS2. b, mapas Cryo-EM (antes da nitidez final no Phenix para construção do modelo) de TNKS2 SAM–PARP (à esquerda) e depois de mascarar o PARP (à direita). Os protofilamentos antiparalelos estão relacionados entre si por simetria D1. A, sítio aceitador; D, área doadora. As setas amarelas indicam a polaridade do protofilamento. c, Representação esquemática da estrutura do filamento quaternário, com letras indicando diferentes protômeros (ver Dados Estendidos Fig. 3j). d, mapa crio-EM adicionalmente aguçado e modelo de um único protômero TNKS2 SAM–PARP. O domínio PARP do PDB 5NWG33 é sobreposto em verde para ilustrar características mal resolvidas do site aceitador. Veja Dados Estendidos Fig. 2 para detalhes de processamento de dados, e Dados Estendidos Fig. 3 para detalhes do mapa e análise da mutação G1032WTNKS2.

Como a polimerização tankyrase induz sua atividade PARP permanece desconhecido. Aqui descrevemos a estrutura de microscopia crioeletrônica de 3 Å (crio-EM) de uma unidade ativa mínima polimérica de tankyrase, revelando uma nova arquitetura de dupla hélice que permite interações recíprocas entre domínios PARP para ativar alostericamente a tankyrase.

0.05). See Extended Data Fig. 9c,d for data from the +tankyrase inhibitor condition. g, Model for the activation of catalytic and non-catalytic tankyrase functions by polymerization. The dashed arrow indicates de-polymerization. Double-headed red arrows indicate interactions./p>monomeric); Fig. 5e and Extended Data Fig. 9a), in line with polymerization inhibition by auto-PARylation3. Additionally breaking SAM–SAM head-to-tail contacts (G1032WPARP Y920ASAM)4 resulted in nearly 100% monomers (Fig. 5e and Extended Data Fig. 9a). Although the PARP–PARP head combination mutant was just as catalytically impaired as G1032WPARP (see above), it appeared less polymeric (approximately 35% >monomeric), also than the wild-type protein, indicating that PARP–PARP head interactions contribute to polymerization. Note, however, that the studied species are probably dissociation products of larger polymers lost by dilution as PARP–PARP contacts are not expected to form in these very short filaments (see Discussion). The H1048AD-loop mutation conferred increased polymerization, comparable with G1032WPARP, suggesting that the associated reduction in catalytic activity is sufficient to favour polymerization (Fig. 5e and Extended Data Fig. 9a). Mutation of the interprotofilament contact (R896DSAM) and SAM/linker–PARP interface (on the SAM domain side) did not detectably reduce polymerization (Fig. 5e and Extended Data Fig. 9a). Variants containing combined PARP domain mutations in the PARP–PARP tail and SAM/linker–PARP interfaces appeared less monomeric, but presented with a higher tendency to stick to the glass surface, potentially due to aggregation, hindering reliable quantification (Extended Data Fig. 9a,b and Supplementary Video 1)./p>

monomeric events, with s.e.m., using Microsoft Excel for Mac (v16.57) and GraphPad Prism (v9.3.1). Note that the quantifications in Fig. 5e and Extended Data Fig. 9b show the percentages of particles that are monomeric or multimeric; this is distinct from the percentages of protein molecules in different assembly states (monomeric or >monomeric). For example, a mass photometry peak corresponding to dimers and of equal height to the monomer peak contains twice as many proteins./p>

monomeric species used for quantification. The three species marked with asterisks have poorer separation between peaks due to a higher tendency of molecules to repeatedly bind and unbind to and from the glass surface (see Methods for details). b, Analysis of mass photometry data for additional PARP domain mutant variants as in Fig. 5e (n = 5 independent experiments; individual data points and means; error bars, SEM). Data for controls (WT, G1032WPARP, G1032WPARP Y920ASAM) are identical to Fig. 5e and shown again for reference purposes. As for a, the three species marked with asterisks should be interpreted with caution. c, Fluorescence microscopy as in Fig. 5f, but after application of a tankyrase catalytic inhibitor. d, Quantification of c (n = 3 independent experiments; individual data points and means; error bars, SEM). e, Differential scanning fluorimetry of the indicated variants of His6-MBP-TNKS2 SAM-PARP. Data are means from three parallel technical replicates. f, g, Coomassie-stained SDS-PAGE gels of purified His6-MBP-TNKS2 SAM-PARP fusion proteins for quality control. Sufficiently high protein yield did not require repeated purifications for most of the variants (n = 1)./p>

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